ABSTRACT
En el presente trabajo se verificó la presencia de algunas enzimas relacionadas con la pared celular vegetal (poligalacturonasa, pectato liasa, proteasa y xilanasa) en raíces de clavel (Dianthus caryophyllus L.). Así mismo, se determinaron los niveles de actividad de las mismas. Estos niveles se analizaron en diferentes espacios celulares: en el fluido intercelular que hace parte del apoplasto, en el simplasto y en el tejido total de las raíces de clavel (apoplasto y simplasto). Para extraer el fluido intercelular, se ensayaron dos metodologías. Para obtener el contenido intracelular (simplasto) y el extracto total (apoplasto y simplasto) en raíces de clavel se ensayaron tres metodologías que utilizaban como solución i) extractante buffer fosfato, ii) buffer fosfato con PVPP y iii) lavados con acetona a las raíces de clavel, antes de la extracción con buffer fosfatos. Los resultados mostraron el efecto de las diferentes soluciones en las actividades enzimáticas y en el contenido de proteína. Se propuso una de estas metodologías para extraer las cuatro enzimas en un único paso y realizar análisis comparativo de actividad enzimática.
The presence of some enzymes related to cell wall (polygalacturonase, the pectate lyase, protease and xylanase) in carnation (Dianthus caryophyllus L.) roots as well as the activity levels were determined. These levels were analyzed in different cellular places: the intercellular fluid that is part of the apoplast, the symplast, and the total level (apoplast and symplast) in carnation roots. Two methods were tested to extract the intercellular fluid. To obtain the intracellular content (symplast) and total extract (apoplast+symplast), three methods were tested, using as extracting solution i) phosphate buffer, ii) phosphate buffer + PVPP, iii) before the extraction with phosphate buffer, the carnation roots were washed with acetone. The results showed the effect of different extracting solutions in the enzymatic activities and in the protein content. A new only one step method is proposed to extract the four enzymes and make the comparative analysis of enzymatic activity.
No presente trabalho foi evidenciada a presença de algumas enzimas relacionadas com a parede celular vegetal: poligalacturonasa, pectato liasa, proteasa e xilanasa e se determinaram seus níveis de atividade, em raízes de cravo (Dianthus caryophyllus L.). Os níveis se analisaram em diferentes espaços celulares: no fluido intercelular que faz parte do apoplasto, no simplasto e no tecido total das raízes de cravo (apoplasto e simplasto). Foram avaliadas duas metodologias para extrair o fluido intercelular. Para obter o conteúdo intracelular (simplasto) e o extrato total (apoplasto e simplasto) se avaliaram três metodologias que utilizavam como solução extratora i) buffer fosfato, ii) buffer fosfato com PVPP e iii) lavados com acetona às raízes de cravo, antes da extração com buffer fosfato. Os resultados mostraram o efeito das diferentes soluciones nas atividades enzimáticas e no conteúdo de proteína. Se propõem uma de estas metodologias para extrair as quatro enzimas num único passo e realizar a analise comparativa da atividade enzimática.
ABSTRACT
Wickerhamomyces anomalus, una levadura aislada de frutas cítricas en la provincia de Misiones, Argentina, produce una poligalacturonasa (endo-PG) con capacidad macerante de tejidos vegetales. El objetivo del presente trabajo fue determinai los parámetros cinéticos y estequiométricos del crecimiento de W. anomalus y la producción de la enzima poligalacturonasa en un medio de cultivo sintético, operado en sistema por lote, en un biorreactor a escala laboratorio. Los cultivos se realizaron en un biorreactor de 4 l que contenía 3 l de un medio sintético compuesto por glucosa, pectina de citrus, vitaminas, aminoácidos, sulfato de amonio y sales, y se incubaron con agitación y aireación, a 30 °C durante 12 h. El transcurso de proceso fermentativo se siguió por medidas de biomasa, glucosa residual, actividad poligalacturonasa y contenido de O2 y CO2 de los gases a la salida del reactor. La velocidad específica de crecimiento máxima (-im) de W. anomalus fue de 0,337 h-1 y el rendimiento de biomasa producida (Yx/s) de 0,401 gx/gs. Al finalizar el cultivo, la actividad PG en el sobrenadante fue de PG de ~ 83,7 UE/ml. La actividad específica y la productividad obtenidas fueron de ~ 1,91. 10(4) UE/gx y ~ 9.301 UE/l.h, respectivamente. El cociente respiratorio fue cercano a 1 durante el proceso fermentativo. No se formó ningún otro producto, además de biomasa y CO 2 . El cultivo por lote resultó ser una buena alternativa para la producción de PG a partir de W. anomalus, obteniéndose un extracto con elevada actividad enzimática, en un medio de cultivo sintético y de bajo costo.
Wickerhamomyces anomalus, a yeast isolated from citrus fruit peels in the province of Misiones, Argentina, produces a polygalacturonase (endo-PG) with maceration activity of vegetable tissues. The objective of the present work was to determine kinetic and stoichiometric parameters of W. anomalus growth and polygalacturonase production in a synthetic culture medium, operating in a batch-type bioreactor at laboratory scale. Cultures were performed in a bioreactor of 4 l, containing 3 l of a synthetic medium composed of glucose, citrus pectin, vitamins, amino acids, ammonium sulfate and salts, and were incubated with agitation (450 rpm) and aeration at 30 °C, during 12 h. The course of the fermentation process was followed by measuring biomass, residual glucose, polygalacturonase activity and O2 and CO2 content of outlet gases from the reactor. The maximum specific growth rate (Um) of W. anomalus was 0.337 h-1 and the biomass yield (Yx/s) was 0.40 gx/gs. At the end of the culture, PG activity in the supernatant was ~84 UE/ml. The specific activity and the productivity obtained were ~1.91 104 UE/gx and ~9,301 UE/l.h, respectively. Respiratory quotient was approximately 1.0 throughout the fermentation process. No other product different from biomass and CO2 was detected. Batch culture could be an adequate alternative for the production of polygalacturonase from W. anomalus and an extract with high enzymatic activity using a synthetic and economic culture medium could be obtained.
ABSTRACT
Durante el periodo de poscosecha el principal problema de deterioro del lulo (Solanum quitoense Lam) es el ablandamiento que es generado principalmente por actividad de enzimas pécticas que atacan la red estructural de la pared celular. Esta investigación se basó en la búsqueda de las mejores condiciones de extracción y medida de actividad de las enzimas pectinesterasa, poligalacturonasa y pectato liasa; herramientas necesarias para estudiar posteriormente el rol de estas enzimas en el deterioro por ablandamiento sufrido por el fruto debido a diversos cambios metabólicos. Se encontró que las dos primeras enzimas pueden ser extraídas simultáneamente con buffer fosfatos 20 mM pH 7,0 + NaCl 0,06 M y 60 min de extracción, relación 1:2 (material vegetal: buffer de extracción), a su vez, pectato liasa se extrajo con buffer fosfatos 20 mM pH 7,0 + cisteína 20 mM y 30 min de extracción, relación 1:3. Para la cuantificación de la actividad pectinesterasa es necesario incubar 15 min a 42 °C 2.500 µL de extracto enzimático crudo (EE) en buffer fosfatos 20 mM pH 7,0 + NaCl 0,15 M y 1,6% de pectina cítrica como sustrato, con valores de Km aparente de 3,78% de PC y Vmax 17,95 µmolH+/min*mg prot. Para la cuantificación de la actividad poligalacturonasa es necesario incubar 15 min a 37 °C 30 µL (EE) en buffer acetatos 200 mM pH 4,5 + NaCl 0,25 M y 1,0% de APG como sustrato, con valores de Km aparente 0,141% de APG y Vmax 28,46 nKat/s*mg prot. Para la cuantificación de la actividad pectato liasa es necesario incubar 2 min a 17 °C 100 µL (EE) en buffer TRIS:HCl 50 Mm pH 8,5 + CaCl2 4 mM y 0,1% de APG como sustrato, con valores de Km aparente 0,0865% de APG y Vmax 82,75 µg/s*mg prot.
The main problem of post-harvest deterioration of lulo (Solanum quitoense Lam) is the softening is the main problem of post-harvest deteriorarion of Lulo, that is generated mainly by the activity of pectic enzymes, which attack the structural network of the cell wall. This research was based on finding the best conditions structural cell wall network for extraction and measurement of enzyme activity pectinesterase (PE), polygalacturonase (PG) and pectato liasa (PL); tools needed to study the further role of these enzymes in the deterioration of pectatelyase fruit softening, due to various metabolic changes. It was found that the first two enzymes can be extracted simultaneously with 20 mM phosphate buffer pH 7.0, 0.06 M NaCl and 60 minutes of extraction, ratio 1:2 (plant material: extraction buffer), pectatelyase extracted with 20 mM phosphate buffer pH 7.0, 20 mM cysteine and 30 minutes of extraction, ratio 1:3. For quantification of pectinesterase activity is necessary to incubate 15 minutes at 42 ° C, 2500 µL of crude enzyme extract (EE) in 20 mM phosphate buffer pH 7.0, to 0.15 M NaCl and 1.6% citrus pectin as (CP) substrate with apparent Km values of 3.78% CP and Vmax 17.95 mol H+/min * mg prot. For the quantification of pectinesterase activity is necessary to incubate 15 minutes to 42 °C 2500 µL of crude enzyme extract (EE) in 20 mM phosphate buffer pH 7.0, 0.15 M NaCl and 1.6% citrus pectin as substrate with apparent Km values of 3.78% CP and 17.95 µ Vmax mol H+/min*mg prot. For the quantification of polygalacturonase activity is necessary to incubate 15 minutes to 37 °C 30 µL (EE) in 200 mM Acetate buffer pH 4.5, 0.25 M NaCl and 1.0% of APG as substrate, with apparent Km values 0.141% of APG and Vmax 28.46 nKat/s*mg prot. For the quantification of the pectatelyase activity is necessary to incubate 2 minutes to 17 °C, 100 µL (EE) in buffer TRIS: HCl pH 8.5, 50 mM 4 mM CaCl2 and 0.1% PGA as substrate, with apparent Km values 0.0865% of APG and Vmax 82.75 µg/s*mg prot.
ABSTRACT
Polygalacturonase (PG) production by Fomes sclerodermeus using solid-state fermentation (SSF) was carried out. Maximal PG activity (26 U/gdw) was obtained between days 11 and 13 at the end of exponential growth. PG activity in the crude extract was more stable at pH 5-6 and 30 °C and had optimum activity at pH 5 and 50 °C. Optimal conditions for PG extraction were: one time extraction with Na2SO4 as solvent with 10 min. of agitation. In a scale-up system, PG activity per gram of dry substrate decreased about 60% compared with the activity obtained in an Erlenmeyer flask; however, high total PG activity was obtained.
Se estudió la producción de poligalacturonasa (PG) por Fomes sclerodermeus usando técnicas de fermentación en estado sólido. La actividad PG máxima (26 U/g ps) fue observada entre los días 11 y 13. La actividad PG en los extractos crudos fue más estable a pH 5-6 y 30 °C, con una actividad óptima a pH 5 y a 50 °C. Las condiciones óptimas para la extracción de PG se lograron con una única extracción empleando Na2SO4 como solvente, con 10 minutos de agitación. En el escalado del sistema, la actividad PG por gramo de peso seco de sustrato disminuyó cerca de 60% comparada con la obtenida en frascos Erlenmeyer, pero la actividad total fue mayor.
Subject(s)
Coriolaceae/enzymology , Fungal Proteins/isolation & purification , Polygalacturonase/isolation & purification , Cell Fractionation/methods , Coriolaceae/growth & development , Fermentation , Hydrogen-Ion Concentration , Mycology/methods , Solvents , TemperatureABSTRACT
Se estudió por ensayos in vitro la posible participación de las enzimas endopoligalacturonasa (PG) (EC.3.2.1.15) y pectato liasa (PL) (EC.4.2.2.2), consideradas factores de virulencia en el proceso de infección del clavel por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (FOD). Los resultados muestran la inducción de la expresión de la enzima PG en presencia de los inductores artificiales, ácido poligalacturónico (APG) y pectina, y un nivel de expresión muy bajo en cultivos con pared celular (PC) de clavel de variedades resistente y susceptible. La enzima PL no presentó expresión en presencia de inductores artificiales (APG y pectina), mientras que en cultivos inducidos con pared celular de raíz presentó un alto nivel de expresión.
The Polygalacturonase (PG; EC 3.2.1.15) and the Pectate lyase (PL; EC 4.2.2.2) are considered as factor of virulence. These enzymes were studied during the infection process of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (FOD) on Carnation (Dianthus caryophillus L.) using culture medium in vitro. The results show the induction of the expression of the PG enzyme when the artificial inductors polygalacturonic acid (APG) and pectin are present. The level of expression was very low in culture with cellular wall (PC) of carnations of the resistant and susceptible varieties. The PL enzyme did not show expression in the presence of artificial inductors (APG and pectin) but in induced culture with root and cellular wall showed a high level of expression.